La sepsis humana se asocia con disfunción secuencial de órganos que se presenta a lo largo del tiempo tras el insulto séptico. Sólo los modelos que permiten una monitorización prolongada a lo largo del tiempo ofrecen la oportunidad de estudiar la disfunción de los órganos asociada al insulto séptico. Por ejemplo, se puede observar disfunción orgánica en ratas durante las 96 horas tras LPC [3], y cambios en la permeabilidad capilar pulmonar en ovejas a lo largo de 72 horas tras LPC.

Asimismo, el deterioro de la reactividad vascular y la disminución y posterior normalización de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo, cambios característicos de la sepsis humana y reproducidos en modelos animales, requieren un tiempo para desarrollarse.

Modelos en los que la mortalidad precoz sea muy elevada o el tiempo de observación sea reducido no ofrecen la oportunidad para el desarrollo de disfunción de órganos, y serán inadecuados para ciertos estudios en los que se pretenda estudiar efectos de intervenciones sobre la aparición secuencial de fallo orgánico tras el estímulo séptico.

Los modelos de LPC son aptos para la evaluación de terapias en los cambios fisiopatológicos inducidos por la sepsis. Los modelos agudos de endotoxinemia están limitados en general a períodos cortos de observación, y permiten evaluar el efecto de intervenciones terapéuticas sobre cambios precoces tras el estímulo séptico.

El conocimiento en los años 50 de que la endotoxina tiene un papel central en la fisiopatología de la sepsis llevó al desarrollo de modelos animales en los que se intentaba reproducir algunos cambios característicos de la sepsis mediante la administración de endotoxina. La elevada dosis de endotoxina que se requiere para producir estos cambios resta relevancia clínica a los modelos experimentales. La administración es en bolos por vía intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.). Con el objeto de facilitar que el huésped disponga de tiempo suficiente para desarrollar una respuesta patofisiológica al insulto, se puede administrar mediante infusión continua a través de la implantación de una bomba de infusión osmótica. Este modelo ofrece la ventaja adicional de que se puede estudiar al animal consciente durante varios días.

La respuesta a la endotoxina depende de la especie, y en algunos aspectos difiere marcadamente de la que caracteriza a la sepsis humana. En perros, la administración de una dosis letal conduce a hipotensión desde el primer minuto, vasoconstricción venosa hepática y disminución del retorno venoso. La presión arterial se normaliza durante la primera hora. Posteriormente, el gasto cardíaco y la presión arterial disminuyen y el animal fallece en el contexto de una situación hipodinámica [4].

Por el contrario, la administración de endotoxina a primates subhumanos se asocia con una disminución del gasto cardíaco sin hipotensión, y –a diferencia de lo que se observa en pacientes- un aumento de la diferencia arterio-venosa de oxígeno. La hipotensión es un evento preterminal.

El modelo de endotoxinemia no es propiamente hablando un modelo de sepsis, pues el estímulo que conduce a los cambios fisiopatológicos no es infeccioso. La endotoxinemia es, pues, sensu stricto, un modelo de inflamación sistémica, más que un modelo de sepsis. Sin embargo, se acepta como modelo para estudiar la fisiopatología de la sepsis, ya que la endotoxina es una molécula central en la fisiopatología de la sepsis. En el 44% de los enfermos críticos se encuentran niveles elevados de endotoxina [5], algunos de los cuales presentan infección por bacterias grampositivas. En estos casos, el origen de la endotoxina probablemente sea las bacterias gramnegativas de la luz intestinal. Los niveles de endotoxina se relacionan con el desarrollo de disfunción multiorgánica y con la mortalidad [6].

Los modelos de endotoxinemia en roedores presentan limitaciones adicionales. Las dosis necesarias para producir shock son 10-100 veces superiores a las necesarias en humanos. A diferencia de la hiperglicemia y el aumento persistente de la gluconeogénesis encontrada en humanos, los roedores tratados con endotoxina presentan una hiperglicemia transitoria que rápidamente evoluciona hacia una situación de hipoglicemia. La hipotensión inducida por la endotoxina no se debe a vasodilatación, como en humanos, sino que sucede en el contexto de un aumento marcado de la resistencia sistémica [7].

La administración de dosis elevadas de endotoxina a conejos (5 mg/kg) produce una situación hipodinámica, mientras que la administración de dosis menores (1-3 mcg/kg) induce una respuesta hiperdinámica semejante a la observada en humanos [8, 9]. En ratas se han encontrado diferencias semejantes [10, 11].

La mortalidad a las 48 horas puede ser fácilmente manipulable mediante la dosis, desde 10% con 5 mg/kg en bolus i.p. hasta 80% con 20 mg/kg en bolus i.p.

La administración a ratas de 5 mg/kg en bolus i.p. se asocia con una mortalidad a las 48 horas del 10%, mientras que la misma dosis i.p. administrada en 24 horas se asocia con una mortalidad del 0%. La misma dosis i.v. de 5 mg/kg se asocia con una mortalidad del 0% o del 90%, según se administre a lo largo de 24 horas o de 4 horas [12, 13].

También se ha descrito un modelo de sepsis inducido por la administración i.v. continua de endotoxina, con el objeto de remedar la situación clínica de endotoxinemia continua. La administración i.v. de endotoxina a la dosis de 3 mg/día produce hipercatabolismo e hipotensión, y es apropiado para el estudio de cambios metabólicos y cardiovasculares [14].

La administración i.v. de endotoxina en ratas produce una elevación marcada y transitoria de la concentración de endotoxina en el suero, mientras que la administración por vía i.p. produce una elevación más progresiva durante las 3 horas siguientes al estímulo [15].

La sensibilización a los efectos de la endotoxina se puede conseguir también mediante la administración previa de plomo, muramil-dipéptido o mediante la inducción de una infección por bacterias gramnegativas.

A diferencia de otras especies (primates, perros, roedores) la oveja es notablemente sensible a la endotoxina, y presenta cambios cardiovasculares y  pulmonares semejantes a los encontrados en pacientes con sepsis [19].

El pulmón de la oveja es, junto con el del caballo, el más semejante anatómicamente al humano. El hecho de que el ganglio linfático mediastínico caudal recoge, prácticamente sin contaminación sistémica, sólo linfa pulmonar permite, mediante la medición del flujo linfático, estimar en la ecuación de Starling-Pappenheimer cuál es el flujo transvascular de fluido. Por eso, el modelo de fístula linfática pulmonar crónica se ha establecido como el modelo ideal para el estudio del flujo transvascular pulmonar en condiciones de bacteriemia o endotoxinemia. Numerosos estudios han demostrado que la administración de pequeñas dosis de endotoxina (1 mcg/kg) o de bacterias produce un aumento del flujo transvascular pulmonar [20]. Ese modelo ha permitido identificar dos fases en los cambios circulatorios pulmonares tras la administración de endotoxina. La fase inicial se caracteriza por hipertensión pulmonar debida a un aumento de la presión hidrostática capilar y elevación del tromboxano A2, con formación de edema pobre en proteínas [21]. En una segunda fase el edema pulmonar se debe a un aumento de la permeabilidad y la presión en la arteria pulmonar disminuye.

A diferencia de las ratas, los conejos y los humanos son muy sensibles a pequeñas dosis de endotoxina. La administración de 4 ng/kg iv induce un cuadro gripal en 90 min., fiebre y taquicardia, que alcanzan un máximo a las 2-3 horas, y un aumento de la concentración sérica de ACTH y adrenalina. Se puede detectar un aumento del TNF desde el minuto 90, que alcanza un máximo a las 3 horas, y es indetectable a las 4 horas. Los niveles de IL-6 e IL-8 alcanzan un pico a las 3 horas post-endotoxina, mientras que los niveles de IL-1-β e IFN-γ no cambian. La respuesta hemodinámica consiste en hipotensión, aumento del gasto cardíaco y disminución de la resistencia vascular, cambios que son máximos a las 3 horas post-endotoxina [22-25]. Entre los cambios cardiovasculares que pueden ser relevantes para la respuesta humana a la sepsis se encuentra una disminución de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo.

La endotoxinemia se asocia con un pico de actividad t-PA a las 2 horas post-endotoxina, que desaparece hacia la hora 3, seguida de un aumento de la actividad PAI, que alcanza un máximo a las 4-5 horas y desaparece hacia la hora 24 post-endotoxina. El aumento del PAI coincide con la aparición de signos de activación de la coagulación. El perfil coagulopático consiste, pues, en una activación transitoria de la fibrinolisis seguida de una fuerte inhibición de la fibrinolisis durante las horas en que la coagulación se encuentra máximamente activada. Todos estos cambios favorecen la formación de depósitos de fibrina en la microcirculación.

Los cambios hemodinámicos y bioquímicos se normalizan a las 9 horas tras el estímulo séptico.

La administración de bacterias por diversas vías en roedores puede reproducir varios cambios característicos de la sepsis humana. Sin embargo, su relevancia clínica está limitada por el hecho de que estos insultos consisten en la administración de dosis muy elevadas de bacterias, en modelos en los que el huésped es incapaz de localizar la infección, a diferencia de lo que suele ocurrir en la situación clínica.

La administración de E. coli vivos en dosis de 10¹⁰ UFC a cobayas induce una respuesta hipo o hiperdinámica, según que la administación sea i.v. o subcutánea. [26, 27, 28].

La inyección de bacterias vivas por vía oral o i.p. induce un estado de sepsis en las ratas. Dependiendo del germen, de la dosis y de la suspensión en la que se vehiculizan los gérmenes, la mortalidad puede ser nula [7], o del 100% en 48 horas [29, 30].

Tanto las ovejas como los cerdos se caracterizan por presentar disfunción pulmonar tras la administración i.v. de bacterias. Este cambio, que no se observa en perros y roedores, se debe probablemente a la presencia de macrófagos intravasculares pulmonares [31].

En el modelo porcino no se ha podido inducir una respuesta hiperdinámica a pesar de una resucitación con fluidos agresiva [32]. En ovejas, la infusión de P. aeruginosa o endotoxina a lo largo de 30-60 min. se asocia con una respuesta hiperdinámica tras una corta respuesta hipodinámica. La administración de dosis más elevadas de bacterias origina únicamente una respuesta hipodinámica.

El modelo de sepsis en primates ofrece la ventaja de que, debido a la proximidad filogenética de estas especies con el hombre, la respuesta cardiovascular y respiratoria es semejante a la presentada por los humanos. Además, existe reactividad cruzada con numerosas moléculas humanas, lo cual facilita la determinación de su concentración. [33, 34].

La administración intravenosa de E. coli en primates anestesiados, traqueostomizados y monitorizados hemodinámicamente produce una bacteriemia que es aclarada de la circulación en 15 minutos tras la interrupción de la infusión [35]. Los microorganismos persisten en los tejidos a las 8 horas de la infusión i.v., pero no a las 72 horas post-infusión.

La infusión i.v. de E. coli en dosis de 2x10¹⁰ UFC durante 8 horas en animales anestesiados y resucitados con Ringer lactato (RL) 5 ml/kg/h. al principio del experimento, y RL 18-35 ml/kg/hr hacia el final del experimento, se asocia con una respuesta hiperdinámica caracterizada por taquicardia, hipotensión y aumento del gasto cardíaco. Otros cambios encontrados fueron leucopenia, trombopenia, acidosis e hipoxemia. También se observa liberación de proteasas (elastasa, catepsina, colagenasa), activación del complejo terminal del complemento y activación de C3, y signos bioquímicos de coagulación intravascular diseminada. El modelo se acompaña de necrosis tubular aguda, hepatocitolisis y colestasis. El hígado, pulmón, adrenales e intestino delgado presentan en el examen histológico edema, hemorragia y signos de coagulación intravascular.

Si la dosis administrada de E coli es menor y durante un período de tiempo de infusión más corto (5x10⁸ UFC/kg durante 2 horas), se observa, en comparación con el modelo utilizando una dosis mayor, una menor hipotensión y un menor aumento del gasto cardíaco. Los cambios bioquímicos y morfológicos, y en la función de los órganos son menos marcados.

Con el objeto de estudiar el efecto sobre la mortalidad de intervenciones farmacológicas, se ha diseñado un modelo subcrónico consistente en la administración de E coli (2x10⁹ UFC/kg i.v.) durante 2 horas, retornando el animal a su jaula, donde continua intubado, recibiendo fluidos y soporte ventilatorio si se requiere, durante un período de observación de 72 horas. La mortalidad de este modelo es elevada, en torno al 80-90%.

Con el objeto de simular la situación clínica en la que el paciente puede sufrir repetidos episodios de bacteriemia, se ha diseñado un modelo subcrónico en el que el animal recibe 3 dosis de E. coli (1x10⁸ UFC/kg. el primero, seguido de dos administraciones de 5x10⁷ UFC/kg) cada 24 horas. Este modelo se asocia con una mortalidad del 50-60%, menor y más tardía a la asociada a la dosis única mayor.

En resumen, el modelo agudo de  bacteriemia en primates es adecuado para el estudio de cambios hemodinámicos asociados al shock séptico. El modelo subcrónico es pertinente para el estudio de terapias que tengan un impacto sobre la mortalidad, así como para el análisis de cambios bioquímicos y morfológicos, que requieren un mayor período de tiempo para su desarrollo.

Otro modelo experimental de sepsis consiste en la administración i.p. de bacterias vivas o material fecal. La inoculación fecal de ratas produce una respuesta hipermetabólica y es letal durante los siguientes 5 días [36]. La administración i.p. de bacterias vivas en cultivo puro o con un adyuvante produce bacteriemia. Sin embargo, de la misma forma que la endotoxinemia, en este modelo el huésped no tiene oportunidad de localizar la infección y desarrollar una respuesta completa compensatoria.

Se puede inducir peritonitis mediante la implantación de cápsulas de gelatina que contienen sulfato de bario y heces. El sulfato de bario es un irritante que aumenta la respuesta inducida por las bacterias. Este modelo se asocia con una elevada mortalidad a las 72 horas [37].

La peritonitis en perros inducida mediante la implantación de un coágulo infectado se realiza mediante la colocación en el peritoneo de un coágulo de fibrina que contiene bacterias gramnegativas. El animal puede ser mantenido despierto durante días, sometido a tratamiento antibiótico y a resucitación con fluidos. La respuesta cardiovascular consiste en hipotensión, disminución del gasto cardíaco y resistencia vascular sistémica normal, que evoluciona hacia una situación de aumento del gasto cardíaco, normotensión y disminución de la resistencia vascular. La fracción de eyección del ventrículo izquierdo disminuye tras la implantación del coágulo, alcanzando un mínimo al día 2-3, para luego nomalizarse hacia el día 7.

El modelo permite el estudio de la respuesta de la función cardiovascular a diferentes dosis del estímulo séptico y a diferentes intervenciones terapéuticas [38-40].

La ligadura del ciego produce una peritonitis debido a necrosis del ciego. Sin embargo, estudios posteriores [41, 42] demostraron que las ratas forman en torno al área necrótica un absceso tabicado que toleran considerablemente bien, sin mostrar mortalidad en períodos de seguimiento de hasta un mes.

La punción del ciego antes de retornar el intestino a la cavidad permite el paso de flora intestinal al peritoneo de una forma continua, dando lugar a una peritonitis por un mecanismo similar al que presentan los enfermos con perforación intestinal. El modelo es, pues, de gran relevancia clínica, y presenta una mortalidad fácil de manipular variando el tamaño de las perforaciones intestinales.

Estos animales presentan bacteriemia y, debido a la naturaleza del insulto, tienen tiempo de desarrollar una respuesta. Se observa una respuesta hiperdinámica durante las primeras 12 horas tras la LPC, que evoluciona a un estado hipodinámico hacia la hora 16-24, presentando hiperlactatemia, hipoglucemia, y una mortalidad del 95% a las 72 horas.

El modelo es de gran utilidad para estudiar cambios metabólicos y hemodinámicos de la sepsis, así como para analizar cambios en la mortalidad inducidos por diversos tratamientos.

Para optimizar los modelos de sepsis es fundamental considerar si el animal es tratado de forma similar a un paciente, incluyendo la reposición de volumen, la antibioterapia y el tratamiento quirúrgico.

La reposición de volumen es esencial para mantener la circulación y el funcionamiento de los órganos. En los modelos de endotoxemia, la fluidoterapia modifica la supervivencia y las características hemodinámicas, y en los modelos con perforación influye de manera significativa en la respuesta inmunológica [43-45]. En la mayoría de los estudios de LPC en ratas se administra un bolo único o bolos repetidos de salino fisiológico 30-60 ml/kg. por vía subcutánea [46-50]. Para remedar de forma más precisa la situación clínica, en algunos modelos se administra una infusión continua tras el bolo inicial [51-54].

En los animales grandes se puede administrar una dosis de fluidos fija [55-57] o ajustar la dosis de manera individual [58-61].

La ausencia de fluidoterapia en los modelos de sepsis causa interacciones serias entre la sepsis y el shock hipovolémico subsiguiente. La fisiopatología y la función inmune varían significativamente si se administra o no fluidoterapia [62]. A pesar de ello, algunos autores evitan la administración de fluidos para controlar mejor las condiciones experimentales, aunque esto ponga en peligro la validez de los resultados [63].

La administración de antibióticos se puede hacer con dos objetivos: comprobar la eficacia de los mismos en el desarrollo de la sepsis [64-66] y hacer el modelo más clínicamente relevante [67-71].

El diseño experimental en un modelo tratado con fluidos y antibióticos sirve de guía para el diseño de ensayos clínicos posteriores y así conseguir resultados más válidos que cuando se emplean nuevas estrategias en animales no tratados.

La intervención quirúrgica es una parte fundamental del tratamiento de la sepsis. Por eso, algunos modelos consisten en un estímulo séptico acompañado de un tratamiento quirúrgico, que consiste en la excisión quirúrgica del foco infeccioso y el lavado peritoneal tras LPC [72-75].

Los modelos pre-clínicos de sepsis han contribuido definitivamente al conocimiento de numerosos aspectos de la sepsis humana. No se pueden revisar aquí de forma exhaustiva todos los conocimientos sobre la sepsis que están originados en el estudio de modelos animales, sino sólo aquellos que son más relevantes, particularmente algunos de los que han conducido al diseño de ensayos clínicos.

Como es sabido, en casi todos los ensayos clínicos sobre terapias anti-inflamatorias en humanos (inhibidores de la ciclo-oxigenasa, antagonistas de la IL-1, anticuerpos anti-TNF, antagonistas de la histamina, etc.) se encuentra en pequeño pero no significativo efecto beneficioso asociado a la intervención. Sólo analizando todos los estudios de forma conjunta se encuentra que las diferentes intervenciones meta-analizadas se asocian con un efecto estadísticamente significativo sobre la mortalidad [76-79]. El diseño de estos ensayos clínicos estuvo basado en estudios pre-clínicos en los que se demostraba el papel central de estas moléculas en la respuesta del huésped a la infección, y en el hallazgo de que intervenciones que atenúan esta respuesta inflamatoria se asocian con una mejor supervivencia.

Nosotros hemos revisado todos los estudios realizados en modelos experimentales de sepsis que analizaron los efectos de terapias anti-TNF. Este análisis ha resultado de gran interés, pues permite identificar en esos estudios pre-clínicos áreas de eficacia que fueron posteriormente encontradas en los ensayos clínicos. Tal es el caso de la mayor eficacia del tratamiento anti-TNF en infecciones bacterianas gramnegativas en comparación con infecciones grampositivas [80, 81].

Otro hallazgo de interés [80] fue que, si bien los estudios pre-clínicos que estudian los efectos de anticuerpos anti-TNF demuestran eficacia, aquellos en los que se utilizan animales manipulados genéticamente (como animales deficientes en el gen del TNF, deficientes en el receptor soluble del TNF, o deficientes en el receptor del TNF) no encontraron efecto protector (la mortalidad en el grupo deficiente no era inferior a la del grupo normal). Este hallazgo recuerda el resultado de que en los ensayos clínicos en que se utilizaron dosis elevadas de receptores solubles del TNF la mortalidad empeoró respecto al grupo control [76].

Asimismo, hemos encontrado que el tratamiento anti-TNF está en relación con la mortalidad del grupo control: si la mortalidad es inferior al 50%, el tratamiento produce daño; si la mortalidad es superior al 50%, el tratamiento produce beneficio [80]. Este hallazgo también ha sido encontrado en ensayos clínicos humanos. Hay por lo menos tres tratamientos probados en ensayos clínicos en humanos cuyo efecto sobre la mortalidad está en relación con el efecto del tratamiento: el tratamiento con el antagonista del receptor de la IL-1, con proteína C activada y con anticuerpos monoclonales anti-TNF [81-84].

Estudios en animales y en humanos demostraron que la sepsis se acompaña de un estado sistémico procoagulante, sentando las bases para la hipótesis de que la inhibición de la coagulación en la sepsis humana puede asociarse con una mejor supervivencia [85-91].

El efecto de la terapia anticoagulante en la sepsis grave ha sido estudiada en ensayos clínicos que han investigado el efecto de la administración de los tres anticoagulantes endógenos fisiológicos (la antitrombina III, la proteína C activada [PCA] y el inhibidor de la vía del factor tisular [TFPI]) [84, 89]. Como es conocido, sólo el tratamiento con PCA demostró eficacia, con un NNT de 16 para salvar una vida en la población de estudio, y un NNT de aproximadamente 6 para salvar una vida en aquellos pacientes de mayor gravedad de acuerdo con el número de órganos en disfunción o la puntuación APACHE II (que son aquellos para los que existe aprobación en Norteamérica y en Europa).

El estudio de los mecanismos de hipotensión en la sepsis experimental ha permitido identificar el papel central de la inducción de la óxido nítrico (NO) sintasa inducible (iNOS) en la hipotensión inducida por la endotoxina o por la sepsis. Mientras que el NO liberado en condiciones fisiológicas por la NO sintasa constitutiva (cNOS) resulta necesario para mantener una homeostasis normal en el huésped, el aumento de la expresión de iNOS en la sepsis conduce, entre otros cambios, a una vasodilatación excesiva y a daño en la función celular mediante la formación de peroxinitrito, al reaccionar el NO con el radical superóxido [92-99].

Un ensayo clínico en fase II sobre los efectos de la L-N-monometil-arginina (LNMMA) en pacientes con shock séptico demostró que esta intervención se asociaba con una mayor proporción de enfermos en los que el shock se resuelve a las 72 horas. En base a estos resultados esperanzadores, se diseño un ensayo clínico en fase III para analizar los efectos de esta intervención sobre la mortalidad [100]. Probablemente debido a cambios en el protocolo, que permitían aumentar la administración de LNMMA a dosis mayores y de forma más rápida, se encontró que el tratamiento se asociaba de hecho a una mayor mortalidad.

Posteriormente se encontró en estudios preclínicos que la inhibición selectiva de la iNOS, respetando la acción de la cNOS, mediante la determinados agentes que presentan una mayor afinidad por la iNOS que por la cNOS, se asocia a una mejor superviviencia en la sepsis. Sería de gran interés probar esta hipótesis en pacientes con sepsis [94, 95].

Los modelos de daño pulmonar agudo han permitido describir hace años el concepto de que el pulmón sufre un daño inflamatorio cuando es sometido a un estrés cíclico inducido por el uso de volúmenes corrientes elevados [101, 102]. Estudios posteriores encontraron que bajo estas condiciones ventilatorias se induce una situación de inflamación sistémica. Estos conocimientos pre-clinicos  sentaron las bases para el diseño de un ensayo clínico que comparara el uso de dos volúmenes corrientes en pacientes con síndrome de distrés respiratorio agudo o daño pulmonar agudo. Este estudio encontró una mayor supervivencia en los enfermos ventilados con volúmenes corrientes bajos [103]. Interesantemente, ambos grupos no se diferenciaron en el deterioro de la oxigenación, sino en la duración del fracaso de órganos no pulmonares y en la duración del shock.

Estos conocimientos han conducido a la elaboración de recomendaciones sobre pautas ventilatorias en pacientes con sepsis que potencialmente minimicen el desarrollo de disfunción multiorgánica y mejoren la supervivencia.